MICROSCOPÍA Y CULTIVO IN VITRO Murray,P.et al. MICROBIOLOGÍA MÉDICA. 8a ed 2016, pag.17
A lo largo de los años los microbiólogos han vuelto al laboratorio para crear cientos de medios de cultivo que actualmente se emplean en los laboratorios de microbiología clínica. Aunque las pruebas que permiten la detección rápida de los antígenos microbianos y las pruebas moleculares basadas
en los ácidos nucleicos han sustituido a la microscopia y los medios de cultivo en la detección de muchos gérmenes, la capacidad de observar los microrganismos mediante microscopia y de cultivarlos en el laboratorio sigue teniendo una gran importancia en los laboratorios clínicos. En muchas enfermedades estas técnicas siguen siendo los métodos definitivos para identificar la causa de una infección.
Microscopia
En general la microscopia se utiliza en microbiología para dos fines básicos: la detección inicial de microorganismos y la identificación preliminar o definitiva de los mismos. El estudio microscópico de las muestras clínicas se utiliza para detectar células bacterianas, elementos fúngicos, parásitos (huevos, larvas o formas adultas) e inclusiones víricas presentes en las células infectadas. Las propiedades morfológicas y características, se pueden utilizar para la identificación preliminar de la mayoría de las bacterias, y para la identificación definitiva de muchos hongos y parásitos.
Se utilizan cinco métodos microscópicos generales:
Microscopia de campo claro (óptica)
Los componentes básicos de los microscopios ópticos son una fuente de luz que se utiliza para iluminar la muestra colocada en una platina, un condensador para enfocar la luz en la muestra y dos sistemas de lentes (lente del objetivo y lente del ocular) que se utilizan para ampliar la imagen de la muestra. En la microscopia de campo claro la muestra se ve mediante transiluminación, de manera que la luz procedente del condensador atraviesa la muestra. Después se amplía la
imagen, primero por la lente del objetivo y después por la lente del ocular. La ampliación total de la imagen es el producto de las ampliaciones de las lentes del objetivo y del ocular.
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La limitación de la microscopia de campo claro es la resolución de la imagen (es decir, la capacidad de distinguir que dos objetos están separados y que no son uno solo). La capacidad de resolución de un microscopio está determinada por la longitud de onda de la luz utilizada para iluminar el objeto y el ángulo de la luz que entra en la lente del objetivo (al que se denomina abertura numérica). Los mejores microscopios de campo claro tienen una capacidad de resolución de aproximadamente 0,2 mm, lo que permite ver la mayoría de las bacterias, pero no los virus. Aunque la mayoría de las bacterias y los microorganismos de mayor tamaño se pueden ver mediante microscopia de campo claro, los índices de refracción de los microorganismos y el fondo son similares. Por tanto, los microorganismos se deben teñir con un colorante para poder observarlos, o se debe utilizar un método microscópico alternativo.
Microscopia de campo oscuro
En los microscopios de campo oscuro se utilizan las mismas lentes del objetivo y del ocular que en los microscopios de campo claro; sin embargo, se utiliza un condensador especial que impide que la luz transmitida ilumine directamente la muestra. Sólo la luz oblicua y dispersa llega a la muestra y
atraviesa los sistemas de las lentes, lo que hace que la muestra esté muy iluminada sobre un fondo negro. La ventaja de este método es que la capacidad de resolución de la microscopia de campo oscuro es significativamente mayor que la de la microscopia de campo claro (es decir, 0,02 mm en comparación con 0,2 mm), lo que posibilita la detección de bacterias muy delgadas, como Treponema pallidum (microorganismo causal de la sífilis) y el género Leptospira (leptospirosis). La desventaja de este método es que la luz pasa alrededor de los microorganismos y no los atraviesa, lo que dificulta el estudio de su estructura interna.
Microscopia de contraste de fases
La microscopia de contraste de fases permite examinar los detalles internos de los microorganismos. En esta forma de microscopia, como se hacen pasar haces de luz paralelos a
través de objetos de densidades diferentes, la longitud de onda de un haz se «desfasa» en relación con el otro haz de luz (es decir, el haz que atraviesa el material más denso se retrasa más que el otro). Mediante el uso de anillos anulares en el condensador y en las lentes del objetivo se amplifican las diferencias de fases, de modo que la luz en fase parece más brillante que la luz fuera de fase. Esto crea una imagen tridimensional del microorganismo o de la muestra y permite un análisis más detallado de las estructuras internas.
Microscopia fluorescente
Algunos compuestos, denominados fluorocromos, pueden absorber la luz ultravioleta o ultraazul de longitud de onda corta y emitir energía con una longitud de onda visible y mayor. Aunque algunos microorganismos tienen fluorescencia natural (autofluorescencia), la microscopia fluorescente
habitualmente supone la tinción de los microorganismos con colorantes fluorescentes, y después su estudio con un microscopio fluorescente de diseño especial. El microscopio utiliza una lámpara de vapor de mercurio, de un halógeno o de xenón a presión elevada que emite una longitud de onda de luz más corta que la que emiten los microscopios de campo claro tradicionales.
Se utiliza una serie de filtros para bloquear el calor que genera la lámpara, eliminar la luz infrarroja y seleccionar la longitud de onda adecuada para excitar el fluorocromo. Posteriormente la luz que emite el fluorocromo se amplifica con las lentes del objetivo y del ocular tradicionales. Los
microorganismos y las muestras teñidos con fluorocromos aparecen brillantes sobre un fondo oscuro, aunque los colores varían dependiendo del fluorocromo seleccionado. El contraste
entre el microorganismo y el fondo es suficientemente grande como para que se pueda realizar una búsqueda rápida del microorganismo con bajo aumento y después el material se explora con mayor aumento, una vez que se ha detectado fluorescencia.
Microscopia electrónica
Al contrario que otras formas de microscopia, en los microscopios electrónicos se utilizan bobinas magnéticas (y no lentes) para dirigir un haz de electrones desde un filamento de tungsteno a través de una muestra y hacia una pantalla.
Dado que la longitud de onda en este caso es mucho más corta que la de la luz, la resolución y la ampliación mejoran drásticamente. Con microscopia electrónica se pueden ver partículas víricas individuales (en contraposición con los cuerpos de inclusión víricos). Las muestras habitualmente se tiñen o se recubren con iones metálicos para crear contraste. Hay dos tipos de microscopios electrónicos: microscopios electrónicos de transmisión, en los cuales los electrones, igual que la luz en los microscopios ópticos, atraviesan directamente la muestra, y microscopios electrónicos de barrido, en los que los electrones rebotan en la superficie de la muestra con un determinado ángulo y se genera una imagen tridimensional.
METODOS DE CULTIVO
El éxito de los métodos de cultivo depende de la biología del microorganismo, del lugar de la infección, de la respuesta inmunitaria del paciente frente a la misma y de la calidad del medio de cultivo.
Relativamente pocos laboratorios preparan en la actualidad sus propios medios de cultivo. La mayor parte son producidos por empresas con experiencia en la fabricación de los mismos. Aunque esto aporta evidentes ventajas, también implica que la mayoría de los medios de cultivo no sean «recientes». Aunque en general esto no representa un problema, puede condicionar la recuperación de algunos gérmenes de crecimiento difícil (p. ej., Bordetella pertussis). Por tanto, los
laboratorios que realizan pruebas sofisticadas con frecuencia disponen de la capacidad de fabricar una cantidad limitada de medios de cultivo especializados. Se comercializan fórmulas deshidratadas de la mayor parte de estos medios de cultivo, lo que permite esta fabricación con mínimas dificultades.
Tipos de medios de cultivo Murray,P.et al. MICROBIOLOGÍA MÉDICA. 8a ed 2016, pag.19
Los medios de cultivo se pueden clasificar en cuatro grupos generales: 1) medios no selectivos enriquecidos, 2) medios selectivos, 3) medios diferenciales y 4) medios especializados
- Medios de cultivo no selectivos enriquecidos. Estos medios están diseñados para permitir el crecimiento de la mayor parte de los gérmenes que no necesitan unas condiciones exigentes. Los siguientes medios son algunos de los más empleados:
- Agar sangre. Los laboratorios clínicos utilizan muchos tipos de medios de cultivo agar sangre. Los medios contienen dos componentes fundamentales: un medio basal (p. ej., soja tripticasa, infusión de cerebro-corazón, base de Brucella) y sangre (de oveja, caballo, conejo). Se pueden añadir varios suplementos más para ampliar el número de gérmenes que se pueden cultivar en estos medios de cultivo.
- Agar chocolate.
- Agar Mueller-Hinton.
- Caldo tioglicolato o tripticasa soya (caldo nutritivo). Se trata de uno de los medios de cultivo de enriquecimiento empleados para recuperar cantidades pequeñas de bacterias aerobias y anaerobias. Se emplean diversos compuestos, pero la mayor parte incluyen caseína, glucosa, extracto de levadura, cisteína y tioglicolato sódico.
- Agar dextrosa de Sabouraud.
- Medios de cultivo selectivos y diferenciales. Los medios de cultivo selectivos se diseñan para poder recuperar gérmenes específicos que pueden estar presentes en una mezcla de otros gérmenes (p. ej., un patógeno entérico en las heces). Los medios se enriquecen con inhibidores que suprimen el crecimiento de los gérmenes no deseados. Estos
medios se hacen diferenciales añadiendo ingredientes específicos que permiten la identificación del germen en una mezcla
- Agar MacConkey.
- Agar sal manitol.
- Agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD).
- Medio de Lowenstein-Jensen (LJ).
- Agar Middlebrook.
- CHROMagar.
- Agar con inhibidor de hongos filamentosos
- Medios especializados. Se han creado muchos medios de cultivo especializados distintos para detectar gérmenes específicos, que pueden ser exigentes o que se presentan mezclados con muchos otros.
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